新型结核病疫苗HP13138PB的构建及其生物信息学分析和体外验证

点击蓝字 关注我们

作者：程鹏1,2，江帆3，王贵元1,4，王杰1，薛勇1，王亮2，龚文平1

作者单位：1解放军总医院第八医学中心结核病医学部研究所；2解放军总医院第八医学中心老年医学科；3空军军医大学基础医学院；4河北北方大学

通信作者：龚文平, Email：gwp891015@whu.edu.cn；王亮，Email: Wangl309@sina.com

Bioinformatics analysis and consistency verification of a novel tuberculosis vaccine candidate HP13138PB

Peng Cheng1,2, Fan Jian3, Guiyuan Wang1,4, Jie Wang1, Yong Xue1, Liang Wang2, Wenping Gong1

Front Immunol, 2023, 14:1102578.

doi: 10.3389/fimmu.2023.1102578.

PMID: 36825009.

研究背景

结核病 (tuberculosis，TB) 是由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis，MTB) 感染引起的经呼吸道传播的一种传染病。接种疫苗是预防和控制结核病最有效的方法。卡介苗 (BCG) 是唯一获得许可的TB疫苗，其对儿童粟粒性肺结核和结核性脑膜炎具有良好的保护作用，但其对成人肺结核的保护效率不佳。随着生物信息学和免疫信息学的快速发展，基于多肽的疫苗已成为最具吸引力的疫苗研发策略之一。本研究利用生物信息学和免疫信息学技术设计了一种新型的结核多表位疫苗HP13138PB，并通过免疫信息学工具对该疫苗的抗原性、免疫原性、理化参数、二级结构、三级结构和免疫反应特性进行了预测和分析。为进一步评价生物信息学和免疫信息学技术预测和分析结果与真实世界实验数据之间的一致性，我们在体外通过分子克隆技术成功表达了多表位疫苗HP13138PB，并采用酶联免疫斑点试验 (ELISPOT) 和CBA细胞因子检测试剂盒分析了HP13138PB诱导人IFN-γ+ T淋巴细胞增殖和Th1/Th2/Th17型细胞因子产生的水平。

研究方法和结果

一、多肽疫苗HP13138PB的构建及人群覆盖率分析

基于生物信息学方法，我们成功地从17个MTB保护性抗原（Ag85A、Ag85B、ESAT6、EspA、Mpt63、MTB32A、PPE18、RpfB、TB10.4、CFP10、MPT51、MPT64、MTB8.4、PPE44、PPE68、RpfA、RpfB）中预测出了13个HTL表位、13个CTL表位和8个B细胞优势表位。这些优势表位具有良好的抗原性、免疫原性，且无致敏性和毒性。我们将这些优势表位通过连接子连接后构建了一种结核新型多肽疫苗，并将其命名为HP13138PB。为了进一步提高该疫苗的免疫原性和靶向性，我们在疫苗设计中加入了抗菌肽人β-防御素3 (HBD-3)、TLR2激动剂PSMa4及辅助肽PADRE（图1）。此外，我们还通过IEDB数据库对HP13138PB疫苗在全球人群的HLA-I（CTL表位）和HLA-II（HTL表位）等位基因的覆盖率进行了分析。结果发现HP13138PB疫苗在全球人群的HLA-I（CTL表位）和HLA-II（HTL表位）等位基因的覆盖率分别为92.07%和73.60%。

图1 HP13138PB疫苗的构成示意图和氨基酸序列

二、多肽疫苗HP13138PB的理化性质

HP13138PB疫苗由705个氨基酸组成，其分子量为70 245.98 Da，理论等电点为9.41。该疫苗在哺乳动物网织红细胞中的半衰期为30 h，在酵母体内的半衰期>20 h，在大肠杆菌体内的半衰期>10 h，这些数据均表明HP13138PB疫苗具有良好的稳定性。此外，我们还预测了HP13138PB疫苗的溶解度，其值为0.55，高于平均阈值0.45，表明HP13138PB疫苗具有良好的溶解性。

三、多肽疫苗HP13138PB的免疫学特性预测

一个理想的疫苗必须能够刺激免疫细胞产生特异性和非特异性免疫应答，进而清除体内MTB的感染。在本研究中，我们预测了HP13138PB疫苗诱导B细胞、NK细胞、巨噬细胞、CD4+ T细胞 (Th1和Th2) 和CD8+ T细胞产生免疫应答的潜力。模拟结果表明，该疫苗分子免疫3次后能够刺激Presenting-2型巨噬细胞 (图2A) 和DCs (图2B) 数量形成3个峰值，且以此降低。

图2 HP13138PB疫苗模拟免疫诱导固有免疫细胞增殖情况

特异性免疫细胞在宿主清除MTB中扮演着至关重要的角色。因此，我们还模拟分析了HP13138PB疫苗3次免疫注射诱导的特异性免疫应答。结果发现，HP13138PB疫苗能够诱导记忆性TH细胞（图3A）和活性TH细胞显著增殖，并形成3个随免疫次数逐渐升高的峰值。CD8+ T细胞可通过分泌细胞毒性物质杀伤MTB。C-ImmSim服务器分析表明，免疫注射后非记忆性TC细胞数量在1150 个/mm3达到峰值 (图3C)。当活跃的TC细胞数量达到峰值600 个/mm3时，静息TC细胞的数量最低 (图3D) 。B细胞在体内主要产生体液免疫，在第三次免疫模拟注射后，B细胞数达到>720 个/mm3 (图3E)。此外，HP13138PB疫苗诱导产生了高水平的IgM和IgG抗体 (图3F) 和特异性细胞因子，比如IFN-γ、IL-2、TGF-β、IL-10和IL-12等（图4）。

图3 HP13138PB疫苗模拟免疫刺激特异性免疫细胞产生免疫反应

图4 HP13138PB疫苗模拟免疫刺激特异性免疫细胞产生细胞因子水平

四、体外验证HP13138PB疫苗诱导的细胞因子水平

为了进一步评价HP13138PB疫苗在计算机模拟和体外真实世界实验数据之间的一致性，我们从健康人群（HC）、结核分枝杆菌潜伏感染者（LTBI者）和活动性结核病（ATB）患者中收集了外周血单个核细胞（PBMC）。ELISPOT实验结果表明，与阴性对照AIM培养基相比，HP13138PB疫苗能够体外刺激HC、LTBI者和ATB患者的PBMC中IFN-γ+ T细胞显著增殖 (图5)。

图5 ELISPOT检测HP13138PB疫苗刺激ATB、LTBI和HC人群的IFN-γ+ T细胞增殖情况

我们还检测了HP13138PB疫苗体外刺激HC、LTBI者和ATB患者PBMC产生IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IL-17A等细胞因子的能力。结果表明，与AIM培养基刺激HC的PBMC产生细胞因子水平相比，HP13138PB疫苗能够诱导ATB、HC和LTBI的PBMC产生明显高水平的IL-4 (图6A)、IL-6 (图6B)、IL-10 (图6C)和IL-17A (图6D)等细胞因子。HP13138PB疫苗在ATB患者和HC中诱导的TNF-α水平明显高于AIM培养基在HC中诱导的TNF-α水平 (图6E)。此外，ATB患者中HP13138PB疫苗诱导的IFN-g水平明显高于HC中AIM培养基诱导的IFN-γ水平 (图6F)。无论是HP13138PB刺激还是AIM刺激，我们发现IL-2水平在HC、ATB、LTBI人群中差异均无统计学意义 (图6G)。

图6 HP13138PB疫苗诱导人PBMC产生的细胞因子水平

意义及展望

综上所述，研究表明生物信息学和免疫信息学技术在研发结核多表位疫苗方面具有显著优势。本研究基于MTB的17个保护性抗原预测的HTL、CTL和B细胞表位，设计了新型结核多表位疫苗HP13138PB，发现HP13138PB疫苗具有较高的抗原性和免疫原性且无毒无致敏性，易溶于水。此外，HP13138PB疫苗可与TLR2紧密结合并诱导免疫应答。体外实验表明，HP13138PB疫苗能够诱导HC、LTBI者和ATB患者PBMC产生高水平的IL-2、IL-4、IL-10和IL-17A等细胞因子，这些结果与生物信息学预测结果相一致。这些发现为评估计算机模拟与体外或体内实验的一致性提供了证据，也为开发新的结核病疫苗奠定了基础。