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1.引言

“生命分析化学”是研究生命体系中各种成份、结构单元以及相互作用过程中的变

化，建立生命活动过程中生物分子检测新原理、新方法与新技术，对生命物质进行特异、灵敏、快速地定性、定量监控，实现分子识别和生物信息提取的一个新兴交叉领域。

近20年来,生命科学蓬勃发展，因此，生命分析化学对于理解生命活动机制至关重要，而且生命分析化学还可以对生命活动过程提供生物学上的见解，可以说生命科学的发展与生命分析化学技术的进步息息相关。

1.1微芯片电泳技术在生命分析中的应用
由于MCE具有试剂和样品消耗量小、分离效率高，分析速度快、检测灵敏度高、分析成本低等优点，可运用于生命分析化学的各个领域。MCE的基本应用主要包括：基因突变检测、核酸检测、药物分析、蛋白质分析、细胞分析等。

• 微芯片电泳技术应用于核酸检测

核酸包括DNA和RNA两大类，随着科学技术的发展已经开发出了多种简单灵敏的检测方法用于这两大类核酸的检测。Li等人设计了一种联合了MCE与CL技术的新型传感平台，对microRNA进行高灵敏度检测。此MCE-CL系统的原理如图1-1所示。

该系统中主要设计了一个与靶标有部分互补序列的发夹探针，利用靶标把此探针的发夹结构打开，形成复合物miR-30b/Probe，随后加入含有G4序列的另一条DNA链，这条G4链与发夹探针红色区域碱基互补两者杂交后形成双链DNA，最后加入Nb.BbvCI，利用其在该识别位点选择性切割双链DNA，使得靶标不断的得以循环。

图1.1基于MCE-CL新型传感平台，对microRNA高灵敏度的检测分析

• 微芯片电泳技术应用于蛋白质检测

蛋白质是一种非常重要的与很多疾病相关的生物标记物，在生物分析领域也具有非常重要的作用。我们都知道微芯片电泳的通道尺寸非常小，同时也意味着样品消耗量非常少，这一点对于蛋白质的微量检测而言是非常有利的。

利用微芯片电泳技术对蛋白质进行检测可以联合荧光，化学发光等手段。本课题组Qin等提出了一种新的检测γ-干扰素（IFN-γ）的方案，利用微流控芯片的电泳驱动控制电渗流利用激光诱导荧光形成MCE-LIF平台，集样品的进样，分离，检测于一体，体现了微流控电泳的便于集成，快速高效分离的特点。

图1.3基于MCE-LIF传感平台，快速分离目标物进而检测IFN-γ

• 微芯片电泳技术应用于细胞检测

Rakszewska提出了基于液滴微流控平台利用水凝胶珠对单细胞的mRNA进行定量检测。

通过DNA功能化的水凝胶珠作为一种基质去捕获单细胞中的mRNA，随后通过逆转录，产生cDNA，引入锁式探针进行滚环扩增（RCA），再加入能与RCA产物互补杂交的荧光探针，从而对单细胞中的mRNA进行定量。该方法扩展了现有技术的潜力，为从单个细胞中捕捉我们所需的分子提供了一个通用的平台。

图1.4基于液滴微流控平台利用水凝胶珠对单细胞的mRNA进行定量检测

2.基于微芯片电泳分离辅助化学发光信号放大检测p53基因

2.1方法设计与实验原理

实验原理如图2-1所示，辣根过氧化物酶(HRP)标记的探针单链DNA（HRP-DNA），与靶标p53部分互补，探针DNA与靶标p53杂交，

当加入T7Exo时，T7Exo沿5'→3'方向降解RNA/DNA杂交双链上的DNA，当探针DNA链被降解后，与其杂交的目标DNA序列p53重新与新的HRP-DNA杂交，T7Exo继续进行降解，如此循环，靶标p53可产大量信号分子，从而实现目标信号放大。

由于体系中加入的HRP-DNA过量，因此整个循环反应结束后，体系中存在HRP标记的单核苷酸，与过量的HRP-DNA，两者均可催化H2O2氧化luminol反应产生化学发光。

利用MCE-CL在一分钟内对HRP标记的单核苷酸，HRP-DNA进行分离，由于两者分子量不同，会产生一前一后两个峰，根据HRP标记的单核苷酸峰高的变化，可以实现对p53基因的定量分析。

图2-1 T7Exo辅助信号放大MCE-CL检测p53的实验原理

为了验证方案的可行性，我们对三种不同条件的试样进行MCE-CL检测，结果见图2-2，进行空白试验时只出现一个电泳峰。

随后，我们加入靶标p53序列，可以看到除了HRP-DNA的电泳峰外还在上游位置出现了另一个新的电泳峰，这是由于p53存在时启动了整个循环反应在T7Exo作用下从HRP-DNA上切下来的HRP标记的单核苷酸，

由于两者的荷质比不同而出现先后出峰的现象，荷质比大的组分先出峰，即HRP标记的单核苷酸先出峰，HRP-DNA后出峰。

图2-2原理可行性验证实验电泳图

(a)8.0×10-8mol/LHRP-DNA，(b)8.0×10-8mol/LHRP-DNA+1.0×10-10mol/Lp53，(c)8.0×10-8mol/LHRP-DNA+2.0×10-9mol/Lp53。图中1号峰为HRP-DNA的电泳峰；2号峰为HRP标记的单核苷酸的电泳峰。

2.2结论

本研究建立了一种MCE-CL分析法检测p53基因，该分析方法具有仪器结构简单、检测速度快、灵敏度高、高特异性、操作方便等优点。我们对芯片电泳分析和化学发光检测的条件进行了优化，60s内实现了有效分离。

p53基因在9.0×10-12mol/L～2.0×10-8mol/L范围内，其浓度对数值与相关化学发光物质的信号强度（CL）存在良好的线性关系，检测限为4.8×10-12mol/L。该方法具有灵敏度高，检测时间短的优点，结合T7Exo辅助信号放大，为发展高灵敏度的MCE-CL方法提供了一种新的途径。

3.基于微芯片电泳分离辅助化学发光信号放大检测HIV-DNA

3.1方法设计与实验原理

基于微芯片电泳具有在线分离功能，可以对待分离物质在极其短的时间内进行有效的分离，而且分离效果明显。

基于MCE-CL平台，以HRP-DNA作为信号探针，利用HRP催化鲁米诺和双氧水化学发光反应及目标分子与DNA的杂交反应，结合T7Exo辅助信号放大，建立了一种MCE分离辅助双循环化学发光信号放大新方法，并应用于HIV-DNA的高灵敏检测，实验原理如图3-1所示。

图3-1酶切辅助HIV-DNA双循环信号放大反应的实验原理

为了验证T7Exo-HRP-MCE-CL平台的双循环放大信号分析方法的可行性，我们对三种不同条件的试样进行MCE-CL检测，结果见图3-2。

当样品未加入靶标HIV-DNA序列时，由以上的实验原理解释可知此时体系中只存在HRP-DNA，所以反应液经微芯片电泳只出现一个电泳峰。随后，我们加入靶标HIV-DNA，切下来的HRP标记的单核苷酸量增多，其HRP标记的单核苷酸的相应峰高也随着增加。

进一步证明了新出现的上游峰为HRP标记的单核苷酸的电泳峰，根据HRP标记的单核苷酸峰高的变化可以对HIV-DNA进行定量分析。

图3-2可行性验证试验电泳图

(a)8.0×10-8mol/LHRP-DNA，(b)8.0×10-8mol/LHRP-DNA+1.0×10-12mol/LHIV-DNA，(c)8.0×10-8mol/LHRP-DNA+1.0×10-9mol/LHIV-DNA。图中1号峰为HRP-DNA的电泳峰；2号峰为HRP标记的单核苷酸的电泳峰

3.2结论

本研究基于T7Exo-HRP-MCE-CL平台建立了一种新的MCE分离辅助双循环化学发光信号放大新方法，并应用于HIV-DNA的高灵敏检测。把反应体系引入到MCE-CL平台可以在短时间内对反应后的待分离物质，进行快速有效的分离（60s内实现了有效分离）。

通过设计双循环步骤，对靶标信号进行双放大，大大的提高了检测的灵敏度，最低检测限可达1.6×10-15mol/L（S/N=3），将其应用于人血清的加标回收分析，结果令人满意，表明该方法可用于复杂的生物样品中微量HIV-DNA的检测，为发展高灵敏度的MCE-CL方法提供了一种新的途径。

4.基于微芯片电泳分离辅助化学发光检测S1核酸酶活及其抑制剂

4.1方法设计与实验原理

基于微芯片电泳具有在线分离功能，可以对待分离物质在极其短的时间内进行有效的分离，而且分离效果明显。利用CL无需激发光源，可以排除背景的干扰对目标物进行检测时可以获得很高的灵敏度。

实验原理如图4-1所示。参考相关文献，我们可知S1酶可对单链DNA进行水解切割，所以当我们在反应混合溶液中加入一定量的S1酶（S1neclease）时，S1neclease就会对体系存在的HRP-ssDNA进行水解产生HRP标记的单核苷酸。

因此整个反应结束后，体系中存在HRP标记的单核苷酸，与过量的HRP-DNA，两者均可催化H2O2氧化luminol反应产生化学发光。

有关文献报道PPi对S1核酸酶的活性有一定的抑制作用，所以我们在S1酶水解单链DNA的反应中加入不同浓度的PPi进行考察。我们根据MCE-CL的实验结果发现加入PPi后S1核酸酶水解单链DNA的反应的确受到了抑制。

为了减少实验结果的误差，我们只改变抑制剂PPi的浓度，其它实验条件保持一致。同样的，把PPi切换成ATP其余实验条件不改变，我们对S1核酸酶水解单链DNA的反应进行考察。

我们根据MCE-CL的实验结果发现加入ATP后S1核酸酶水解单链DNA的反应也受到了抑制。说明ATP对S1核酸酶水解FAM-ssDNA反应的抑制程度也有所增强。

综上结果，我们可以利用所建立的MCE-CL平台对S1核酸酶的活性进行定量检测，并根据MCE-CL的电泳图中有关信号峰高的变化可以对S1核酸酶的抑制剂PPi、ATP进行考察。

为了验证方案的可行性，我们对三种不同条件的试样进行MCE-CL检测，结果见图4-2，当样品未加入靶标S1核酸酶，而只存在HRP-DNA时，只出现一个电泳峰。

随后，我们加入S1核酸酶，可以看到除了HRP-DNA的电泳峰外还在上游位置出现了另一个新的电泳峰，由于两者的荷质比不同而出现先后出峰的现象，荷质比大的组分先出峰，即HRP标记的单核苷酸先出峰（见图中峰2），HRP-DNA后出峰（见图中峰1）。

图4-2可行性验证电泳图

(a)8.0×10-8mol/LHRP-DNA，(b)8.0×10-8mol/LHRP-DNA+1.0×10-3U/mLS1核酸酶，(c)8.0×10-8mol/LHRP-DNA+2.0×10-2U/mLS1核酸酶。图中1号峰为HRP-DNA的电泳峰；2号峰为HRP标记的单核苷酸的电泳峰

4.2结论

本文利用DNA-HRP作为一种信号探针，构建了一个检测S1核酸酶活性的化学发光传感平台，并运用于血清加标实验，实验取得令人满意的结果表明该体系的构建也适合复杂生物体系。

优化各项缓冲条件以及最佳反应时间，在优化的实验条件下，S1核酸酶的浓度在1.0×10-1U/mL～3.0×10-4U/mL的范围内，其浓度的对数值与体系的化学发光强度呈现良好线性关系，检测限（S/N=3）为1.56×10-4U/mL。

实验还对S1核酸酶的两种抑制剂ATP，PPi的抑制效果进行了考察，结果表明该方法可用于S1核酸酶的抑制剂的筛选，而且有望用于进行与核酸酶相关的药物筛选和基础研究。