文|顾煜祺

编辑|顾煜祺

前言

低温等离子体 (LTP) 具有经过验证的杀菌活性，该活性受生成的活性氧和氮物质 (RONS) 控制，这些活性氧和氮物质以微生物细胞成分为目标，RONS 也与环境中的生物分子相互作用。

肠沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌在不存在 [例如磷酸盐缓冲盐水 (PBS)] 的情况下存活率降低，但在（高）有机物含量 （Dulbecco 改良鹰培养基 (DMEM)、添加胎牛血清的 DMEM和溶源性肉汤）。

PBS 中经 LTP 处理的细菌的活力降低与膜完整性的丧失相关，而在处理过的单细胞中无法检测到双链 DNA 断裂。

等离子体设置和处理条件

低温等离子体 (LTP) 的抗菌活性因其在伤口净化方面的可能应用而引起了生物医学领域的极大兴趣，部分电离的气体是活性氧和氮物质 (RONS)的重要来源，已知会对细胞中生物分子的结构和功能造成氧化损伤。

这些氧化还原反应并不局限于靶细胞中的 RONS 和生物分子，因为 RONS 的非特异性作用使其能够与细菌环境中存在的生物分子发生反应。

这对于伤口去污尤为重要，因为源自伤口渗出液、碎片和宿主组织细胞的生物分子可能与 LTP 产生的 RONS 发生反应。

与含有生物分子的环境相比，LTP 已被证明在缺乏生物分子的水性环境中应用时具有更高的杀菌效果，LTP 处理会导致一系列生物分子受损或发生变化。

这种损害已被原位记录，即在活细菌细胞中以及纯化的成分，这些影响主要归因于 RONS，尽管活性成分的特性和组成因所使用的 LTP 源而异，LTP 对液体环境中细菌的生物学效应将是气相 RONS 与液体环境及其中的成分相互作用的结果。

当细胞和非靶标生物分子（例如，直接细菌环境中的氨基酸、维生素和碳水化合物）在 LTP 应用过程中存在时，这可能特别相关，生物分子可以改变细菌的生理状态，从而促进对 LTP 诱导的损伤的抵抗力。

使用了中描述的平行场 AP-DBD 等离子射流，在 12 kV（峰峰值）、30kHz 的玻璃管（内径 1 毫米，外径 6 毫米）内点燃等离子体，进料气流为 2 slm 的氦气（99.996%）和 0.5 % (v/v) 氧气（99.6%）。

样品在 20%–24% 的环境湿度下处理 90 秒，之前已经证明，这种处理时间足以抑制这种细菌菌株的生长， 喷嘴与样品之间的距离为30mm。

使用了五种不同有机物和盐含量的液体：1.去离子水；2.磷酸盐缓冲液（PBS）；3. Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，Gibco）；4. 添加 10% (v/v) 胎牛血清的 DMEM (DMEMsupp)；5.溶原肉汤 (LB-Miller, Fisher BioReagents)。

肠沙门氏菌亚种，鼠伤寒沙门氏菌 ST4/74（鼠伤寒沙门氏菌）在 37 °C 的 LB 中有氧生长。然后将对数后期培养物在相应的液体（H 2 O、PBS、LB、DMEM 或 DMEMsupp）中稀释至 600 nm 处的光密度为 0.02（大约1.6 ×10的7次方菌落形成单位/毫升）。

这些细菌悬浮液被保存在冰上，直到 LTP 暴露或电镀（对于未处理的对照），并尽可能短暂（< 15 分钟），每个细菌悬浮液的 100 μL 在 24 孔板中暴露于 LTP 处理，将密封膜 (SealPlate, Excel Scientific) 放置在不暴露于活性血浆成分的孔上，紫外线对这种特定 LTP 的杀菌活性没有贡献。

为了评估 LTP 处理后的生存能力，将经 LTP 处理的样品和未经处理的对照的连续稀释液接种到 LB 琼脂平板上，并在 37 °C 过夜孵育后测定菌落形成单位 (CFU)/mL 的数量。

活/死细菌活力测定和细胞分选

活/死BacLight细菌活力测定 (Molecular Probes) 用于评估鼠伤寒沙门氏菌的细胞活力等离子处理后作为细胞膜完整性的函数，膜不可渗透的核酸染料碘化丙锭 (PI) 仅在细胞膜受损时才对细胞内核酸染色。

相反，可透过膜的 SYTO9 染料标记所有细胞中的核酸含量，样品暴露于 LTP 处理，之后立即进行染色和分析，使用 Beckman Coulter CyAn ADP 流式细胞仪使用 488 nm 激发滤光片（用于 SYTO9 和 PI）和 530/40 nm (SYTO9) 和 613/20 nm (PI) 发射滤光片评估染料吸收。

根据染料吸收将细胞（“事件”）分配给三个群体之一：1.高膜损伤（死亡，SYTO9低PI +）；2.无膜损伤（带电，SYTO9 +)；3.具有中度膜损伤的细胞（中间，SYTO9 + PI +）。

对于细胞分选，如上所述对 LTP 处理的样品进行染色，并使用 Astrios Eq 细胞分选仪（Beckman Coulter Inc.）在 PBS 中收集不同的鉴定种群，并配备 488/526 和 561/613 纳米激发/发射滤光片分别用于 SYTO9 和 PI。

鉴定了四个群体用于细胞分选：1.低活（SYTO9低，PI -）；2.高活(SYTO9 high PI − )；3.中间体（SYTO9 +，PI +）；4.死细胞 (SYTO9 low , PI + )，每个门多达 500 000 个事件在 LB 培养基中分类并处理以确定可行的 CFU 计数。

LTP 处理后，在没有细菌的情况下，在指定液体中进行电子顺磁共振 (EPR) 和自旋捕获。存在羟基自由基 ( • OH)、臭氧 (O 3 )/原子氧 (O)、单线态氧 (O 2 (A1个Δg ))和超氧自由基阴离子 (欧−2个 ) 在液体中通过 EPR 使用自旋捕获进行评估。

自旋陷阱 2,2,6,6-四甲基哌啶 (TEMP)、5,5-二甲基-1-吡咯啉的溶液否 -氧化物 (DMPO) 和 5-(二乙氧基磷酰基)-5-甲基-1-吡咯啉否 -氧化物（DEPMPO）在使用前在相应的液体中以 0.1 M 的浓度新鲜制备。

将 0.1 M 浓度的单线态 δ 氧清除剂叠氮化钠 (NaN 3 ) 添加到 TEMP 溶液中，可以区分由 O 3 / 形成的 2,2,6,6-四甲基哌啶 1-氧基 (TEMPO)的量O 和来自 O 2 (A1个Δg ))。

使用 Hydrion Insta-check 0–13 pH 试纸 (Sigma) 监测溶液的 pH 值，EPR 信号的校准（双积分强度作为自由基浓度的函数）是使用稳定的自由基 TEMPO（Sigma Aldrich）完成的，自旋陷阱加合物的代表性 EPR 光谱显示在补充材料的中。

杀菌活性在有机物含量高的溶液中降低

不同有机和无机含量对 LTP 在液体环境中杀菌效果的影响，并阐述了关键的作用机制，这是使用革兰氏阴性模型细菌S. Typhimurium进行评估的，杀菌作用或“灭活”在此定义为单个细菌无法增殖以在琼脂平板 (CFU) 上产生可见菌落的条件。

暴露于 PBS 中的 LTP 的活细菌减少了 3.5-log（99.9%–99.99% 失活），H 2 O减少了 1.5-log （90%–99% 失活）（P< 0.0001 ）。

紫外线对此处使用的 LTP 的杀菌活性没有贡献，尽管鼠伤寒沙门氏菌具有防止氧化应激的冗余途径，但在 PBS 中通过 LTP 处理对细胞造成的氧化损伤是致命的。

相比之下，使用相同的 LTP 参数和暴露时间，当鼠伤寒沙门氏菌在有机物含量高的液体（DMEM、DMEMsupp 和 LB）中处理时，未观察到生存能力降低。这些结果与之前关于暴露于基于火花的非热等离子体的革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的发现相关。

膜的完整性对细菌的生存至关重要，细胞膜是保护细胞免受外部氧化应激的第一道屏障[19]。LTP 处理可引起蚀刻、脂质过氧化和整体细胞膜损伤，这有助于杀菌活性，通过摄取核酸染料 PI 来评估膜完整性，具有完整膜的细胞不能渗透。

流式细胞术数据的代表性点图，显示了 PI 和 SYTO9 染料的信号，它在所有细胞和单个细胞中染色核酸；LTP 暴露减少了PBS 中具有完整细胞膜（“活”；SYTO9 + PI - ）的细菌数量（P< 0.05 )，数字微机 (P< 0.01 )，和 DMEMsupp (P< 0.001 ）。

对于在 PBS 中处理的细菌，所确定的膜完整性降低与由 CFU 确定的生存力损失相关，相对百分比的差异可能是由于识别“活”细菌细胞的方法和评估生存力的时间点不同所致。

CFU 计数反映生长和分裂的能力，并在孵育 18 小时后进行评估，而流式细胞术计数在处理后立即进行评估，仅反映膜损伤。

CFU 检测包含一个允许主动恢复的时期，膜成分可能会受损，PI 摄取不会增加，但仍会导致细胞死亡，例如细胞膜流动性的变化。

在 DMEM 处理的细菌群体中，具有高细胞膜损伤（“死亡”；SYTO9低PI +；P< 0.05 ），在该培养基中处理后超过 99% 的细胞保留了活力，因此这种损伤对细菌活力的影响并不明显。

LTP 在鼠伤寒沙门氏菌悬浮液中诱导低水平的双链 DNA 断裂

如果细菌基因组中的 DNA 断裂无法修复，则它们是致命的，而 LTP 可诱导 DNA 链断裂，使用 DDD 测定，在 PBS、LB 和 DMEM 中进行血浆处理后单个细胞中鼠伤寒沙门氏菌基因组 DNA 的完整性。

在 LB 和 PBS 悬浮液中对细菌进行 LTP 处理不会导致可检测水平的 dsDNA 断裂，而在 DMEM 悬浮液中。

由于 LTP 处理，具有 dsDNA 断裂的细胞出现了低但显著的增加，这种损伤水平比之前确定的在固体表面上暴露于相同 LTP 源的细胞要低得多，不确定为什么仅在 DMEM 中观察到损伤的轻微增加。

一种可能的解释是通过O 3氧化氨基酸（例如半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）在 DMEM 中形成 H 2 O 2，复杂介质中的铁离子可促进• OH 的形成（通过Haber-Weiss 和 Fenton 反应），从而导致 DNA 损伤。

无论如何，在平行实验中， DMEM 中暴露于 LTP 的细胞没有发生活力丧失，这表明观察到的低水平 DNA 损伤不会导致可检测到的部分细胞群死亡，数据显示，LTP 应用于液体悬浮液中的细胞不会诱导高水平的dsDNA断裂，即使在细胞死亡明显的 PBS 中也是如此。

对细胞造成的 dsDNA 损伤水平可能低于 DDD 检测的灵敏度（因为无法识别单个 dsDNA 断裂），或者发生了其他类型的致命 DNA 损伤，例如单链 DNA 断裂和核碱基氧化，在这些情况下，DNA 损伤可能不是导致细菌细胞死亡的重要因素。

综上所述，数据表明并非所有 DNA 损伤都先于（可检测到的）细胞膜损伤，在这里使用的条件下，细胞膜的损伤可能无法检测到，或者没有发生，并且在摄取起始成分后，DNA 损伤受到细胞内发生的反应的影响。

LTP 处理期间溶液中的营养物质改变了可用 RNOS 的水平

LTP 的杀菌活性受血浆产生并输送到生物基质的 RONS 控制，直接等离子体处理产生的一些生物学相关 RONS 的存在，特别是• OH、H 2 O 2、O 3 /O、O 2 (A1个Δg ),欧−2个 , 和 NO 2 −在没有细菌存在的特定液体中。

H 2 O 2和NO 2 -浓度通过比色法评估，使用自旋陷阱 TEMP、DMPO 和 DEPMPO 通过 EPR 评估高活性和非常短寿命的自由基的数量，自旋陷阱与研究的自由基反应，形成更持久的自由基加合物，可以通过 EPR 检测到。

未测量的其他生物相关活性物质可能存在于反应系统中（例如，过氧亚硝酸盐阴离子），在所有 LTP 处理的样品中，较长的处理时间导致使用的检测到的自旋陷阱加合物、偶氮染料和过氧化物化合物的浓度增加，这是由增加的量引起的相关活性物种。

局部环境会影响 LTP 用于诱导靶细胞氧化损伤的作用机制。对于更传统的防腐剂，例如氯己定和银化合物。

因为它们的抗菌活性受到外源有机物存在的极大影响。尽管在 PBS、DMEM 和 DMEMsupp 中的 LTP 处理细菌中观察到膜损伤，但在有机物含量高的悬浮液中细菌消除被消除。

相比之下，可能存在外部有机成分，例如芳香族氨基酸和维生素（在 DMEM 中），但不存在肽（如在 LB 中）在 LTP 处理期间，有利于在鼠伤寒沙门氏菌中诱导非致死性 dsDNA 断裂。

尽管了解血浆诱导的 RONS 与环境各个成分的相互作用很重要，但这里评估了所有存在的药物的综合影响，综合这些数据，等离子体产生的 RONS 与非目标有机物的相互作用可能是 LTP 杀菌活性降低的原因。

总结

LTP 递送的 RONS 与生物系统中的有机分子之间的复杂相互作用会产生额外的活性物质和潜在的细胞毒性副产物（例如，LB 和 DMEMsupp 中 H 2 O 2和NO 2 -的量增加），它们的存在并不一定会导致显着的细菌灭活，正如在这里展示的那样，它们确实会降低整体杀菌效果。

LTP 处理的S. Typhimurium的杀菌作用可能是 RONS 协同作用引起的分子水平上不同相互作用总和的结果。这种损害不能仅归因于所测量的一种或多种特定物种，而是归因于与短寿命和长寿命物种的各种反应。

参考文献

等离子体损伤控制：从生物分子到细胞和皮肤，ACS Applied Materials & Interfaces，第 13卷，第 39 期，第 46303 页，2021 年

骨癌细胞系中直接等离子体处理和等离子体条件培养基的选择性，《科学报告》，第 11 卷，第 1 期，2021年

冷大气压等离子体射流中氢和氧原子的空间分布 , Plasma Sources Science and Technology，第 29 卷，第 12 期，第 125018 页，2020 年

通过非热等离子体去除水中的甲草胺：活性物质和途径间歇和连续过程，Water Research，第 161 卷，第 549 页，2019 年

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