核酸化学在核糖体失活毒素研究中的应用及抑制剂的发现

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核糖体失活蛋白(Ribosome-inactivating proteins, RIPs)是一类催化核糖体r RNA脱嘌呤反应,从而抑制核糖体功能的毒蛋白。

主要代表为蓖麻毒素(ricin)和相思子毒素(abrin),它们是重要的生物战剂和生物恐怖武器,急需研究此类毒素的检测方法及抑制剂来保障公共安全和中毒救治

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由于此类毒素具有N-糖苷酶活性,可对某些短链DNA或RNA发生脱嘌呤反应,利用仪器分析,可对所释放的腺嘌呤或对脱嘌呤后的寡核苷酸单链进行定量检测。

基于此原理,共设计了29条全RNA序列及DNA-RNA-DNA嵌合序列,并对其活性进行了评价,共筛选出8条蓖麻毒素的新型有效核酸底物Risub4、Risub12、Risub13、Risub14、Risub15、Risub17、Risub18、Risub19、Risub20、Risub21及rA12d6。

通过酶动力学参数的测定与比较发现rA12d6为活性最高的寡核苷酸底物,并联合高效液相建立了蓖麻毒素的活性检测及定量检测方法,最低检出浓度为0.1 ng/mL,检测限LOD值为2.3 ng/mL。

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其次,进行了蓖麻毒素核酸底物的功能基保守性研究及核酸抑制剂的设计与合成。以12个核苷酸单元(12-nt)形成的茎环结构dA12为模板,合成了28条核酸序列。

针对环中心脱氧腺苷的6-位氨基、7-位氮原子以及脱氧鸟苷的7-位氮原子设计了核苷类似物1-4,并合成修饰核酸序列RIN10-RIN12、RIN16-RIN28,结果发现四员环碱基上任一功能基的改变都会影响dA12作为底物的功能。

另一方面,在环中心的脱氧腺苷的6-位氨基及8-位引入了具有平面堆积能力的苄基及成氢键能力较强的氨丙基、组胺基,设计了核苷类似物5-7,并合成修饰核酸序列RIN01-RIN09、RIN13-RIN15,经过抑制活性评价,筛选出了4条有明显抑制活性的核酸序列RIN06、RIN11、RIN16、RIN18,抑制作用均达到微摩尔水平。

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这对Ⅱ型RIPs的抑制剂设计以及化学修饰方法提供了进一步的指导作用。

核糖体失活蛋白及其分类

从目前对于核糖体失活蛋白这类毒素蛋白的研究来看,蓖麻毒素、相思子毒素、皂角毒素、志贺毒素最受关注。尤其是蓖麻毒素和相思子毒素的毒性强,来源广泛,廉价易得,性质稳定,且没有解毒药,已经成为重要的生化战剂和生物恐怖武器。

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1978年的马尔科夫政治谋杀案所用到的就是蓖麻毒素。而且,时有报道针对重要政治人物的蓖麻毒素邮件。因此,它们被列入《化学武器公约》(CWC)附表1A进行监测,是《生物和毒素武器公约》(BTWC)的B类物质。

根据功能域组成,核糖体失活蛋白大致可分为三类,分别为单链的I型RIPs,双链的Ⅱ型RIPs,和多链的ⅡI型RIPs。

I型RIPs是一类结构单一的N-糖苷酶蛋白,不能进入细胞,因此I型RIPs毒性普遍较低。Ⅱ型RIPs由具有N-糖苷酶活性的A链(与I型RIPs功能相同)和凝集素B链构成,凝集素B链可与细胞膜表面的受体如半乳糖受体结合,介导A链进入细胞。

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此外,还有第三种类型的RIPs,但只包括少数几种蛋白,突出代表为茉莉酮酸酯诱导蛋白(JIP60)以及玉米b-32蛋白。

2010年,一个新的命名法被提出,分别对应于传统的分类方法:A型(类型I),AB型(类型Ⅱ),AC型(类型ⅡI,类似于JIP60)和AD型(类型ⅡI,类似于玉米b32蛋白)。

Ⅱ型核糖体失活蛋白毒性及作用机制

Ⅱ型核糖体失活蛋白毒性

三类RIPs毒素中,Ⅱ型RIPs的毒性最强,中毒事例最多,而它们的毒性表现千差万别,可能与内吞途径和细胞种类有关。

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RIPs在进入细胞的过程中可利用不同的内吞途径,并与多种分子结合。另一方面,不同类型细胞表面分布的配体种类和丰度不同,因而RIPs的内吞数量不同,从而表现出毒性差异。

在Ⅱ型RIPs中,典型代表为蓖麻毒素和相思子毒素。蓖毒素在 1 分钟内可灭活上千个核糖体,小鼠静注的LD50值为2.7 µg/kg ,会损害肝、肾等实质性器官,发生出血、变性、坏死病变。对人的致死剂量依摄取途径而异,LD50值大约为3 µg/kg。

相思子毒素的毒性比蓖麻毒素强约75倍,成年人摄入的致死剂量估计为0.1-1.0 µg/kg。其它Ⅱ型RIPs的毒性表现各异,如志贺毒素也有很强的毒性。

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从欧洲接骨木中提取的SNLRP1是一种无毒的Ⅱ型RIPs,同样来源于欧洲接骨木的尼格林b不仅没有凝集素特性,也无毒,因为它能被细胞迅速分解并排泄。

虽然I型RIPs因缺乏B链很难进入细胞,但如果它们能与适当的载体连接,获得进入细胞的机会,就会表现出很强的毒性。这方面的第一个证明是白树毒素与刀豆蛋白的结合,它的细胞毒性比Ⅱ型RIPs更强。

目前针对蓖麻毒素的中毒机制研究较多,首先,其毒性存在明显的剂量依赖性,主要表现为高浓度时以抑制蛋白合成而导致细胞坏死,而低浓度时引发脂质过氧化损伤和诱导细胞凋亡。

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值得注意的是,蓖麻毒素和其它RIPs不仅可以剪切rRNA特定位点的腺嘌呤,还具有针对DNA的去腺嘌呤活性,这说明其对于核酸结构的广泛破环性,因而可引起更广泛的毒性。

其次,这类毒素具有诱导细胞因子的能力,可以解释由蓖麻毒素和其它RIPs引起的多种细胞死亡途径,包括凋亡和坏死等。

目前,对于这类生物毒素的中毒治疗,由于没有解毒药,临床只能采用支持疗法将中毒效应降到最低,如洗胃、导泄、透析等方法。

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Ⅱ型核糖体失活蛋白毒性机制

基于蓖麻毒素的强毒性和现实的中毒施毒事件,因此,以蓖麻毒素的中毒机制,催化反应机制,和抗毒药物研究最受关注。

蓖麻毒素由两个功能蛋白以二硫键连接而成,其一为N-糖苷化酶活性的A链(RTA),对核糖体rRNA实施脱嘌呤反应;其二为凝集素蛋白B链(RTB),具有内吞入细胞的功能。

首先,RTB与细胞膜表面糖脂和糖蛋白上的N-乙酰半乳糖受体结合,通过受体介导进入细胞。此外,还可经过巨噬细胞和肝窦细胞表面的甘露糖受体进入细胞质。

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通过内吞作用进入细胞质后,蓖麻毒素被运送到早期的核内体,在那里大部分的毒素分子被回收到细胞表面,或者通过晚期核内体运送到溶酶体进行降解,晚期核内体具有酸性环境,与溶酶体相似,有利于部分毒素 - 受体复合物解离,解离后的受体可返回细胞膜表面重新行使功能。

一小部分毒素在高尔基体的帮助下先通过逆向运输系统进入内质网,此时,在内质网中蛋白质二硫化异构酶的作用下,A/B两条链解离,A链进入细胞质,并重新折叠成活性构象,发挥N-糖苷化酶活性,产生细胞毒性。

在细胞质,RTA作用于核糖体60S大亚基28S rRNA上的A4324位,发生脱嘌呤反应。A4324位于28S rRNA中的保守环状结构sarcin-ricin RNA loop (SRL)。

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SRL包括一个双螺旋茎和一个含有17个碱基的环,环中心部分含保守片段GAGA,其中第二个腺嘌呤就是28S rRNA的A4324位。

脱嘌呤反应后,氨酰基tRNA-延伸因子EF1-GTP三元复合物与核糖体A位不能结合,阻断氨基酸进位过程,同时也会干扰延伸因子EF2-核糖体-GTP三元复合物的形成,阻碍初生蛋白链在核糖体上从A位到P位的易位,不可逆抑制蛋白质合成,导致细胞死亡。

核糖体上脱嘌呤位点的茎环高级结构由四个保守碱基组成,是蓖麻毒素的脱嘌呤反应所必需的。为此设计了多种截短的核酸茎环底物模型,以rA12N为代表。

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蓖麻毒素对于r A12N的脱嘌呤反应半衰期为8分钟,完全可以替代天然底物进行研究。详细的结构研究表明,在环状区域中,GAGA片段是关键结构域,双螺旋茎结构的Watson-Crick配对也是必须的。

但酶与底物的识别并不十分依赖于茎结构的具体序列。这种截短之后的茎环核酸序列后来还作为RIPs抑制剂研究的结构模板,开辟了新的抑制剂设计思路。

针对蓖麻毒素和相思子毒素的催化脱嘌呤反应机制,主要采用了氨基酸残基突变和晶体结构分析。

研究表明它们的催化结构域组成是十分相似的,虽然一级氨基酸序列不尽相同,但关键的催化氨基酸所处的空间位置是相似的。

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其位置的些微变化没有影响到核酸底物的脱嘌呤反应过程。综合蓖麻毒素的晶体结构分析和关键氨基酸突变对于催化活性的影响,以及蓖麻毒素与多种底物类似物或小分子抑制剂的复合物晶体结构分析,目前已经获得对于蓖麻毒素的催化结构域和催化机制的深入了解。

在甲霉素磷酸盐(FMP)-RTA复合物的晶体结构中,FMP作为AMP(腺苷磷酸盐)的类似物,其杂环平面与RTA的Tyr80和Tyr123形成π-π堆积作用。

另一方面,对以上参与相互作用的氨基酸突变也证实了其对于底物识别的作用。

如果将Tyr80和Tyr123分别突变为Phe,RTA的kcat 分别降低15倍和7倍;当它们分别突变为Ser,则导致活性分别降低160 和70倍。

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从这一突变研究说明Tyr80/Tyr123的苯环是关键功能基,以其平面苯环构筑了一个疏水性口袋,而环上羟基并没有影响到催化反应本身,推测其可能与周围基团之间的氢键对催化结构域局部构象产生一定的影响,使催化反应基团处于更有利的位置。

因此,Tyr80和Tyr123在底物结合事件的亲和性和特异性上发挥了关键作用。

此外,FMP还与周围氨基酸如Gly121,Arg80和Val81之间形成多个氢键,这说明底物与RTA催化结构域之间的功能基和空间大小是匹配的,进一步加强了RTA对于腺嘌呤碱基的识别特异性。

结合以上分析,提出了RTA对于核糖体底物的脱嘌呤反应机制。RTA的Tyr80和Tyr23位于反应位点的狭缝深处,底物片段GAGA的第一个腺苷单元(脱嘌呤位点)与之形成了π-π堆积。

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另外两个关键氨基酸Glu177和Arg180参与了RTA的催化反应。它们具有质子转移能力(图1-3),活化水分子和腺苷单元的糖苷键,并稳定形成的过渡态。

Arg180被认为使腺嘌呤的N3发生质子化,继而发生环上电子的转移,导致C1’-N9裂解。在C1’产生一个氧碳正离子,被Glu177活化的水分子所稳定。

当Glu177或Arg180 转换为Gln,分别导致活性降低1000倍和200倍。而且,Glu177和Arg180 的突变对RTA的Km的影响很小,这也说明它们是催化功能基。

在RTA的催化结构域内还有一个保守的Trp211,其对催化反应的贡献有待进一步研究。

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在空间位置上,它与Arg211平行,可能有助于催化结构域的形成。与这个假设一致的是,当Trp211突变为Phe,对活性的影响很小。

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